本文来自：X-MOLNews

2014年5月19日，加拿大北温哥华发生了一起儿童意外身亡的疑案。遇害者是一名叫Aleka Gonzales的两岁小女孩，出事前一天，小女孩被她母亲托付给母亲的男友Henry Thomas照看，出事地点就在此人家中 [1]。尸检发现，孩子身体上出现了一系列弥散性、轻度撞伤以及一些小擦伤。Henry Thomas声称孩子曾从楼梯上摔下 [1]，法医最初也推测孩子受了钝器伤，但这无法解释死者身上的大面积血肿。考虑到Henry Thomas有养蛇的习惯，法医开始怀疑死亡原因是蛇毒中毒所致。于是，当地**方向高校求助，希望能够通过生化技术鉴定死者血液或**中的动物毒液成分。

Aleka的家人及所制作的怀念海报。图片来源：canoe.com [2]

案情引起了加拿大不列颠哥伦比亚大学（UBC）生物化学家Leonard J. Foster教授的关注，他所领导的团队致力于通过质谱蛋白质组学研究。他立即和当地**方取得联系，希望通过质谱蛋白质组学技术协助**方破案。

Leonard J. Foster教授。图片来源：UBC

一般而言，DNA取证仍然是法医学鉴定中的金**，蛋白组学虽在生物科学领域有广泛应用，但在法医学领域依然处于“婴儿期”。质谱技术常常被用于鉴定小分子类毒性物质，如蓖麻毒素、肉毒毒素等。但是，在某些DNA不存在、降解或含量较低生物样品中，蛋白组学可以发挥重要作用。对于本案，Leonard J. Foster团队需要通过非靶向蛋白组学技术鉴定受害者体液中是否存在蛇毒蛋白，考虑到体液**中背景蛋白种类复杂、数量巨大，而潜在蛇毒蛋白含量甚微，且可能在宿主中毒24小时后（此时法医才开始取样）被宿主代谢或降解，这样的检测犹如“大海捞针”，是一项前所未有的实验挑战。

本案的法医前期曾用氟化物处理部分遇害者血液样品，和未处理样品一起在4 °C保存。Leonard J. Foster团队收到两种形式的样品后，立即将其储存于−80 °C条件下。实验开始时，他们将两种样品解冻，高速离心，取上清液，通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）、胶体考马斯印迹和二维凝胶电泳**证实两种样品中蛋白的完整性差异不大，氟化物处理不会干扰下游蛋白组学**。于是，他们用氟化物处理样品进行下一步**。

为克服“大海捞针”的困难，他们通过免疫清除（Immunodepletion）和凝胶、反相色谱分离相结合的方法，设计4种组合来最大限度提高蛋白组学**的灵敏度和覆盖率：样品经过免疫清除后分别进行凝胶分离（组分A）和反相色谱分离（组分B），样品不经过免疫清除分别进行凝胶分离（组分C）和反相色谱分离（组分D）。在组分A和C中，样品凝胶分离后，通过胰蛋白酶被降解为小段肽链，在组分B和D中，样品则先被胰蛋白酶降解为小段肽链，再通过基础反相色谱进行分离。随后所有组分都通过液相色谱-质谱进行多肽链序列**，并结合蛋白组学软件MaxQuant 进行鉴定。

遇害者血液样品的分离鉴定流程。图片来源：Forensic Sci. Int.

结果显示，MaxQuant 从遇害者血液样品中识别出15006种多肽，最终鉴定出3126种蛋白，其中有111种多肽（0.7%）与101种蛇蛋白（snake proteins）匹配。从鉴定出的多肽数量上看，免疫清除组（组分C和D）显著高于非清除组（组分A和B）（多出约20%）。然而，两种分离手段各有覆盖，孰优孰劣很难区分。实验鉴定的多肽中约53%只来自4种方法之一，尤其引人瞩目的是，鉴定的蛇蛋白多肽中约94%只来自4种方法之一。这表明4种方法彼此没有相对优势，协同使用的效果最好。

4种不同方法鉴定多肽的效果。图片来源：Forensic Sci. Int.

为进一步确定血液中是否存在蛇毒蛋白（snake venom proteins），排除因人蛇蛋白同源序列引起的误差，他们对检测出的蛇蛋白多肽质谱数据进行了人工**。结果显示，111条蛇蛋白多肽系列中只有1条序列与蛇毒功能活性蛋白（磷脂酶A2）匹配，其余的属于蛇类保守管家蛋白，或与蛇毒功能没有明显关联的蛋白。尽管发现的大部分多肽来自于与蛇毒功能没有明显关联的蛋白，但作者还是用证据表明它们实际上也是蛇毒的成分。例如，在受害者的血液中，以及在西部菱斑响尾蛇和东部菱斑响尾蛇的毒液中，作者都发现了一种来自蛇血红蛋白的多肽。在对纯蛇毒毒液的**中，作者总共发现了血液中的5种多肽。综合这些实验证据可以表明遇害者确实是因蛇毒死亡，而造成侵害的极有可能是一种响尾蛇（Crotalus）。

遇害者血液中的部分蛇蛋白多肽。图片来源：Forensic Sci. Int.

Leonard J. Foster团队的实验结论——“遇害者血液中存在蛇毒”——也**了北科罗拉多大学Stephen Mackessy 教授实验室的进一步证实，他们使用的方法是针对蛇毒的ELISA测试。

这些结果为案件提供了关键证据，**签发了对嫌疑人Henry Thomas家的搜查令，当地**方从嫌疑人住宅找到了响尾蛇，并通过后续的DNA测试确定小女孩血液中的蛇毒正是响尾蛇蛇毒。在一系列证据面前，Henry Thomas终于无法抵赖，承认了一项“Failing to provide the necessaries of life”的罪名 [1-2]，并在2019年被当地法庭判刑18个月，由于审判前已经被羁押了3个月，最终Henry Thomas需要在狱中待15个月。

当地**方并未公布案件细节，包括蛇毒是如何进入小女孩身体的。Henry Thomas的辩护律师称，小女孩应该是自己不小心把她手指伸进了装有蛇的笼子并被咬到 [3]。但有消息表明，Henry Thomas有些怪异的习惯，比如“给自己注射蛇毒妄图提高免疫力” [1]，细思极恐……

The application of forensic proteomics to identify an unknown snake venom in a deceased toddler

Queenie W.T. Chan, Jason Rogalski, Kyung-Mee Moon, Leonard J. Foster

Forensic Sci. Int., 2021, 323, 110820, DOI: 10.1016/j.forsciint.2021.110820

参考资料：

1. Child’s Murder Solved: Snake Venom Expert At University Of Northern Colorado Helps Catch Killer

https://denver.cbslocal.com/2019/09/12/aleka-gonzales-steve-mackessy-snake-venom-murder-university-northern-colorado/

2. Man jailed after guilty plea in snake-venom death of B.C. tot

https://canoe.com/news/local-news/fraser-valley-man-handed-15-month-jail-term-after-guilty-plea-in-snake-venom-death-of-b-c-tot/wcm/0d6e1ecb-8ba5-464f-89db-f3501e77341a

3. Agassiz man jailed 15 months in snake venom case

https://www.nsnews.com/local-news/agassiz-man-jailed-15-months-in-snake-venom-case-3113297

（本文由天生西南供稿）

maxquant（化学家帮助破解蛇毒疑案）